基于生物物理原理和噬菌体基因组复制的分子机制,作者独立设计了一个靶向性人工DNA复制体(TADR)。它实现了在活细胞内将大量突变快引入用户指定的任意一段DNA上,同时保证基因组的其他部分不受影响。通过优化,中靶突变率相较没有表达TADR的对照细胞提高了二十三万倍。作者以第一作者和并列通讯作者将此工作发表在Science Advances杂志上,并获批一项美国专利。跟基于出错PCR和体外质粒构建的传统定向进化方法比起来,TADR避免了分子连接、细胞转化等效率极低步骤,使得在活细胞里快速、连续的进化(提高已有或发现新的)分子或细胞表型变成可能。

实验室接下来一个主打方向,是对TADR系统的深入开发和探索应用。

  构建体外适应性免疫系统:用TADR靶向突变于纳米抗体基因、利用细菌展示技术将突变抗体表达于细菌表面来筛选抗原,实现体外适应性免疫系统。

  此设计依赖TADR靶向突变、纳米抗体和细菌展示三种技术。纳米抗体为骆驼科动物特有,它行使其他哺乳动物的抗体的作用:介导适应性免疫反应。但它的分子量远远小于其他抗体,其结构无二硫键,其免疫原性亦低。这些特点使纳米抗体比普通抗体具有药物发现更快速、生产更简单、安全性更高的优势。而它治疗疾病的能力也已被证明:2019年美国药品与食品监管局批准了第一款纳米抗体药,用以治疗血小板减少性紫癜。细菌展示技术将外源蛋白与细胞外膜的膜蛋白融合,进而将其表达在细胞表面;已经广泛应用于蛋白质工程。这两项成熟的技术和最近发表的TADR共同构成体外适应性免疫系统成功构建的基础。

  上述方案为基本方案。其进化过程仍需人为干预(左图,灰色箭头):筛选依赖磁珠分选(MACS)或荧光分选(FACS)等物理或化学体外手段。为省去这些步骤,进一步简化流程,提出基于对噬菌体对细菌感染机制进行改造的加强方案。

 

  TADR靶向突变到目标DNA只有两个简单要求:细胞质里表达由三个蛋白构成的TADR复制体;一段30bp的TADR识别序列被插入到目标DNA的5’上游。从设计原理上,TADR复制体具有模块化特性,即与任何宿主细胞兼容。这些特点,使得TADR能够装配在不同细菌种,快速进化噬菌体。已有关于在实验室偶然得到能杀灭新宿主的噬菌体突变子的报道:有的是对耐受噬菌体的细菌突变子重新获得杀灭力,有的则是对一个新物种的细菌宿主获得杀灭力。这些发现为TADR定制噬菌体提供了经验依据。TADR可以通过三种机制来杀灭致病菌。假设现有一种细菌X的突变子X*,对能杀灭野生型X的噬菌体耐受。那么在野生型X中通过TADR对噬菌体进行突变,并选择能杀灭X*的噬菌体突变株(1. 直接杀灭)。接下来此噬菌体突变株在X*中进行传代,同时开动TADR对其突变。这样可以获得一个噬菌体突变株群体,它们将对可能发生的致病菌抗生素耐受突变子产生一定的预防能力(2. 预混合突变株)。TADR复制体的模块化决定它甚至可以装载到噬菌体基因组,在病灶原位进化噬菌体以实时应对致病菌的突变(3。病灶原位进化)。

 

  就进化而言,生命的意义在于在环境中存活下来、让基因传递到后代。而生物个体在某一种环境中的生存能由多条不同分子途径实现。比如外排泵、核糖体保护蛋白、单加氧酶都能帮助细菌在四环素(一种抗生素)环境中生存。那么,当新的环境来临时(替加酶素;一种四环素类似物),这三种全然不同的化学机制都能进化出新的抗生素耐受性、帮助细菌再次生存下来吗?它们的进化潜力(evolvability)能不能从各自催化的化学反应复杂程度预测出来呢?对于这些进化适应的生化基础的基本问题,我们还一无所知,也无从下手。TADR使得我们可以开始探索这些问题。